罗望子种仁球蛋白结构和功能特性的构效关系（二） m2—总蛋白质的效关系含量

1.3.5 溶解性的罗望测定

参照Garcia等的方法对蛋白溶解性进行测定，将TSG和大豆分离蛋白溶于去离子水中配置成50mg/mL溶液，种仁用2mol/L的球蛋HCl和NaOH溶液调节溶液pH值，于室温下搅拌30min后以4000r/min离心30min，白结取上清液于280nm波长下测定紫外分光光度值。构和功

式中：m₁—上清液蛋白质含量，特性g；m₂—总蛋白质的效关系含量，g。罗望

1.3.6 乳化性和乳化稳定性的种仁测定

参照Garcia等的方法对蛋白乳化性和乳化稳定性进行测定。将TSG和大豆分离蛋白溶于去离子水中配置成质量浓度为10mg/mL的球蛋溶液，使用2mol/L的白结HCl和NaOH对其pH值进行调节，加入等体积大豆油，构和功10000r/min高速剪切2min，特性4000r/min离心15min，效关系测量乳化层体积，罗望液体总体积及30min后乳化层体积。并用如下公式计算乳化性和乳化稳定性。

式中：V₁—乳化层体积，mL；V₂—30min后乳化层体积，mL；V₃—液体总体积，mL。

2 结果与分析

2.1 分子质量

采用SDS-PAGE电泳法，以蛋白质标准品为对照组，对TSG的分子质量进行测定，结果如图1所示。图中最左侧条带为蛋白质标准品，条带1为上样质量浓度8mg/mL的TSG。由图可知，TSG主要由11个亚基条带组成，分布在10～70ku，属于低分子质量蛋白，其中最主要亚基分布在35.34ku及13.83ku两处，其表达量显著高于其它分子质量的条带。蛋白质的亚基组成及大小能够影响蛋白质的功能性质。种子球蛋白普遍包含碱性亚基及酸性亚基，分子质量分别在20～27ku及30～39ku内，其中酸性亚基有利于蛋白溶解性的提高，这主要是由于酸性亚基的结构疏松，有利于促进蛋白质分子的伸展及亲水基团的暴露，从而提高蛋白质的溶解性。而碱性亚基则有利于蛋白持油性的提高，降低蛋白的起泡能力，这可能与碱性亚基的疏水基团较多有关。蛋白亚基的大小及酸性亚基和碱性亚基的比例对蛋白溶解性、起泡性、乳化性等功能特性造成一定的影响进而影响其在食品工业中的生产应用，如：蛋白质亚基组成及大小的不同会导致蛋白质局部厚度不同，致使网状结构密度形成差异，蛋白大分子亚基含量的减少，有利于蛋白溶解性、乳化性、乳化稳定性的提高，进而影响产品营养及加工品质。因此，了解蛋白的亚基组成、大小及亚基与蛋白功能特性的关系可为蛋白的开发应用提供科学指导。

2.2 巯基的二硫键含量

采用DTNB比色法，探究中性条件下TSG中总巯基、游离巯基及二硫键含量，结果如表1所示。

巯基是蛋白质中最具活性的官能团，可改善蛋白质的结构性质进而致使蛋白质功能特性发生改变，巯基发生氧化反应产生的二硫键是稳定蛋白质构象重要的共价键，其可使肽链的空间结构更紧密，有助于维持蛋白质的三维空间结构，因此，二硫键含量高的蛋白质其结构更趋于稳定。此外，巯基和二硫键具有较高的生物活性，含量高时能显著改善蛋白的结构及表面疏水性、溶解度、乳化性和起泡性，其中表面疏水性与游离巯基含量呈线性正相关，这可能是由于随着游离巯基含量的增加，蛋白质解折叠及疏水性残基的暴露，导致蛋白表面疏水性增强所致。二疏键则在乳化凝胶形成过程中对脂肪的稳定起决定作用，由表1可知，TSG中游离巯基含量为（33.97±2.94）μmol/g，二硫键含量为（44.08±3.79）μmol/g，TSG中巯基及二硫键含量均较高，因此功能性质良好，在食品工业上有极大的开发利用价值。

2.3 氨基酸

采用PITC柱前衍生氨基酸分析法对TSG的氨基酸组成及含量进行分析，结果如表2所示。由表可知TSG氨基酸种类组成较齐全，总氨基酸含量为528.17mg/g，其中必需氨基酸含量占总氨基酸含量（E/T）的45.85%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）比值为0.85，均显著高于FAO/WHO理想蛋白质标准中人体必需氨基酸含量/氨基酸总含量（40%）及人体必需氨基酸含量/非必需氨基酸（0.6）标准值。在8种必需氨基酸中，异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸及苏氨酸含量最为丰富，其中异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸均高于FAO中推荐值（异亮氨酸含量4.0%，苯丙氨酸含量6.0%、苏氨酸含量4.0%）。但TSG中缺少含硫氨基酸——蛋氨酸，推测可能是由于酸水解作用导致氨基酸损失所致。此外田琨等研究表明豆科植物中缺乏蛋氨酸，因此蛋氨酸的缺少也可能与TSG提取原料有关。含硫氨基酸中除蛋氨酸外还包括半胱氨酸和胱氨酸，是蛋白质中巯基和二硫键的主要来源，二者可通过氧化还原而互变。TSG中胱氨酸的含量约占总氨基酸含量的5.89%，而青稞蛋白和大豆分离蛋白中仅为1.51%，1.30%，胱氨酸含量的高低直接影响巯基及二硫键的含量，因而致使TSG巯基和二硫键含量较高。

2.4 溶解性

以大豆分离蛋白为对照组，对相同质量浓度不同pH值条件下大豆分离蛋白和TSG的溶解性进行测定，结果如图2所示。由图可知，随着pH值的升高，TSG和大豆分离蛋白的溶解性均呈现先升高后降低而后逐渐平稳升高的趋势。在极端酸性条件pH2.5到等电点时，蛋白质的溶解性发生骤降且在等电点附近时达到最小，其中TSG溶解性从（87.66±4.87）%降低到（12.58±0.97）%，大豆分离蛋白从（94.96±3.97）%降低到（13.07±0.85）%。随后越偏离等电点，TSG及大豆分离蛋白的溶解度越高，pH值到8.5以后，溶解度趋于稳定上升。由于食品加工过程中不涉及极端酸碱的处理，因此本文着重对pH4.0～10.0范围内TSG及大豆分离蛋白的溶解性进行对比分析，发现TSG在pH4.0～10.0条件下的溶解性优于大豆分离蛋白，在中性条件pH7.0时TSG溶解性为（76.74±2.76）%，比大豆分离蛋白高26.9%。

蛋白质的溶解度能够显著影响其它功能特性，因此常被作为评价其加工价值的重要参数。由于蛋白质具有两亲性，因此其溶解度常受到溶液pH值环境及离子强度的影响。当溶液pH值处于蛋白质自身等电点时，蛋白所带电荷数最少，与水分子的作用最弱，此时蛋白质分子间的相互作用力增强，更易发生蛋白质聚集，因而溶解度最低；而在小于或高于等电点的pH值范围时，蛋白质正、负电荷不平衡，蛋白质同水分子的结合能力增强，溶解度随之增加。蛋白质的氨基酸种类也是影响其亲水性/疏水性平衡及溶解度的重要因素，疏水氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸等可通过疏水键相互结合在蛋白质中心形成疏水区域；亲水氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸等则可与水分子形成位于蛋白外侧的亲水区域。可见蛋白质中亲/疏水程度的差异使其呈现出不同的溶解性，TSG的亲水性氨基酸含量为54.98%，大豆分离蛋白亲水性氨基酸含量为46.70%，这是TSG蛋白溶解性高于大豆分离蛋白的主要原因。

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